Новітні рішення в
генодіагностиці

Полімеразна ланцюгова реакція в реальному часі (Real-Time PCR)

Принциповою особливістю полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі є можливість детекції накопичення продуктів ампліфікації безпосередньо під час проведення ампліфікації. Оскільки кінетика накопичення амплікон безпосередньо залежить від числа копій досліджуваної матриці, це дозволяє проводити кількісні вимірювання ДНК і РНК інфекційних агентів. Отримана інформація може бути використана для проведення моніторингу ефективності проведеної терапії, оцінки клінічного прогнозу. На відміну від інших методів кількісного визначення ДНК матриці в пробі, ПЛР в реальному часі не вимагає додаткових маніпуляцій, пов'язаних з титруванням ДНК досліджуваної проби або отриманих в ході ПЛР амплікон, які ускладнюють постановку аналізу і можуть призводити до появи хібнопозитивних результатів. Такий підхід дозволяє відмовитися від стадії електрофорезу, що веде до різкого зменшення ймовірності контамінації досліджуваних проб продуктами ампліфікації, а також дозволяє знизити вимоги, що пред'являються до ПЛР лабораторії.

 

Вступ

Широке впровадження в область практичної охорони здоров'я полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) обумовлено простотою її виконання, низькою собівартістю і надійністю. Разом з тим, сьогодні вже очевидно, що подальший розвиток ПЛР отримає в області кількісного визначення нуклеїнових кислот (ДНК і РНК) інфекційних агентів.

Кількісне визначення ДНК інфекційних агентів в ході лікування дозволяє отримувати інформацію про правильність або безрезультатність проведеної терапії, допомагає передбачати періоди загострення захворювання і вживати адекватних заходів для якнайшвидшого лікування хворого без нанесення шкоди його здоров'ю, пов'язаної з неефективною терапією.

Існує велика кількість способів отримати дані про концентрацію нуклеїнових кислот в пробі методом ПЛР, але всі вони вимагають додаткових трудомістких етапів роботи, пов'язаних з попереднім титруванням виділеної з аналізованої проби ДНК, або отриманих в ході ПЛР амплікон, що призводить до збільшення часу, необхідного для постановки аналізу і складності інтерпретації отриманих результатів [2,5]. Також наявність додаткових етапів роботи збільшує ймовірність помилки і отримання недостовірного результату.

 

ПЛР в реальному часі

На сьогодні існує метод, позбавлений перерахованих вище недоліків – це метод ПЛР в реальному часі (Real-Time PCR) [4]. Суть методу полягає в дослідженні накопичення продуктів ампліфікації за допомогою спеціального приладу без подальшого електрофорезу. Оскільки кінетика накопичення продуктів ампліфікації пов'язана з вихідною кількістю матриці, це дає можливість точно оцінити її кількість [3].

Відмінними рисами даного методу, на відміну від класичної ПЛР, є можливість кількісного визначення ДНК/РНК інфекційних агентів в досліджуваному матеріалі, відсутність стадії електрофорезу, менш суворі вимоги до організації ПЛР-лабораторії і автоматична реєстрація та інтерпретація отриманих результатів.

Відсутність стадії електрофорезу дозволяє мінімізувати ризик контамінації продуктами ПЛР і таким чином різко зменшити число хибнопозитивних результатів. Оскільки реєстрація результатів проводиться безпосередньо в процесі ПЛР, весь аналіз можна проводити в одній-двох кімнатах лабораторії і немає необхідності в окремому приміщенні для детекції продуктів реакції.

Дана методика протягом останніх п'яти років успішно застосовується в найбільших діагностичних і науково-дослідних центрах розвинених країн світу і найближчим часом стане так само широко поширена, як і ПЛР в її сьогоднішньому форматі, завдяки економії виробничих площ, зменшення кількості персоналу і затребуваності кількісного визначення ДНК/РНК.

Використання математичних методів аналізу дозволяє проводити автоматичну інтерпретацію отриманих результатів і знімає проблему суб'єктивної оцінки електрофореграм.

Читати далі​

* При записи на прием, в контактных данных пациента, обязательно оставьте свой e-mail, для того чтобы клиника могла связаться с вами и подтвердить запись! Смс-сервис временно не работает.

Наші
переваги

Матеріальна база

Для постановки ПЛР в реальному часі необхідний спеціальний ампліфікатор, відмінною особливістью якого є можливість порушувати і детектувати флуоресценцію, яка відображатиме накопичення амплікон, на кожному циклі ампліфікації. На сьогодні існує небагато моделей приладів для ПЛР в реальному часі: це «iQ iCycler» («Bio-Rad»), кілька типів «ABI Prism» («Applied Biosystems»), «LightCycler» («Roche»), «SmartCycler» («Cepheid»). Кожен з цих приладів має ряд переваг і недоліків, описувати які не входить в завдання даної статті, однак ми вважаємо, що найкращим приладом по співвідношенню ціна/якість є «iQ iCycler» фірми «Bio-Rad».

 

Детекція продуктів ампліфікації

Для виявлення продуктів ампліфікації в режимі реального часу використовують такі найпоширеніші підходи​:

  • Вищеплення 5'кінцевї відмітки (TaqMan Assay)

Дана методика заснована на використанні 5'-екзонуклеазної активності полімерази. У реакційну суміш додають ДНК-зонди, до складу яких входить флуоресцентна мітка в 5'-положенні і гаситель флуоресценції в 3'-положенні, а також фосфатна група в 3'-положенні. Ці зонди мають місця посадки всередині ампліфіцірованої області. Гаситель поглинає випромінювання, що випускається флуоресцентною міткою, а фосфатна група в 3'-положенні блокує полімеразу.

В ході ПЛР під час стадії відпалу праймерів відбувається приєднання ДНК-зонда до комплементарного ланцюга ДНК, причому чим більше продуктів ампліфікації утворюється в ході ПЛР, тим більше молекул зондів зв'яжеться з відповідними ампліконами. Під час стадії елонгації полімераза синтезує комплементарний ланцюг ДНК і при досягненні зонда починає його розщеплювати завдяки наявності 5'-екзонуклеазної активності. Таким чином відбувається роз'єднання флуоресцентної мітки і гасителя, що призводить до збільшення детектованого світіння [3]. Очевидно, що чим більше амплікон було напрацьовано в ході ПЛР на даний момент часу, тим інтенсивніше буде світіння.

  • Використання зондів з комплементарними кінцевими послідовностями (molecular beacons)

Дана методика відрізняється від описаної вище тим, що кінцеві послідовності зонда є взаємно комплементарні області, тому при температурі відпалу праймерів вони схлопуються і утворюють шпильки [6]. Внутрішня область зондів містить нуклеотидну послідовність, комплементарну ампліфіцируєму область. При відпалі праймерів зонди, що не приєдналися до ДНК матриці, залишаються в «схлопнутому» стані, тому відбувається гасіння флуоресценції.

Ті ж зонди, які відпалюються на матрицю, розгортаються, і флуоресцентна мітка і гаситель розходяться в різні боки. Таким чином, збільшується інтенсивність світіння.

  • Застосування 2-х зондів з резонансним переносом енергії (LightCycler assay)

Даний спосіб детекції накопичення продуктів ампліфікації відрізняється підвищеною специфічністю, оскільки збільшення флуоресценції відбувається при комплементарному зв'язуванні з ампліконом відразу 2-х ДНК зондів [1]. Принцип методу полягає в перенесенні енергії від одного флуорофора, що знаходиться на 3 `кінці першого зонда, до другого флуорофора, що знаходиться на 5` кінці другого зонда, причому відстань між флуорофорами становить 1-3 нуклеотиду.

При одночасному зв'язуванні обох зондів з ДНК матрицею випромінювання, що випускається першим, флуорофор випромінювання передається на другий флуорофор, а його випромінювання детектується приладом. Таким чином, зростає специфічність аналізу.

  • Використання інтеркаліруючих агентів

Цей спосіб детекції заснований на тому факті, що флуоресценція бромистого етидія і SYBR Green I значно зростає при їх впровадженні в дволанцюжкові молекули ДНК [4]. Таким чином, можна спостерігати за накопиченням продуктів ампліфікації.

Дуже важливо відзначити те, що збільшення флуоресценції може бути пов'язано як з накопиченням специфічного продукту, так і неспецифічного (праймери-димери, шмер). Для отримання коректних результатів необхідно додаткове вивчення отриманих амплікон за допомогою побудови так званих «кривих плавлення» (melting curves).

Криві плавлення

Для цього після закінчення ПЛР реакційну суміш нагрівають і безперервно вимірюють флуоресценцію. Після досягнення температури плавлення продукту ампліфікації флуоресценція різко знижується.

Кожне різке зменшення флуоресценції на графіку відповідає числу смужок, одержуваних на електрофорезі, тобто числу різних типів амплікон. Для полегшення роботи з отриманою інформацією проводять диференційний аналіз кривої плавлення. Такий спосіб візуалізації отриманих даних набагато зручніше для розуміння і аналізу.

Застосування кривих плавлення не обмежується тільки детекцією продуктів ампліфікації за допомогою бромистого етидія і SYBR Green I. При використанні кривих плавлення в системах з ДНК-зондами (Taq-man assay, beacons) можливо розрізняти точкові мутації, розташовані всередині областей зв'язування ДНК-матриці і зонда . Наявність таких мутацій здатна привести до зміни температури плавлення зонда і до змін в графіку кривої плавлення [1]. Використання кривих плавлення не вимагає від оператора ампліфікатора ніяких додаткових маніпуляцій з пробірками, а інтерпретація отриманих даних автоматизована і формалізована.

Підводячи підсумки, варто зазначити наступне: використання ДНК-зондів в тому чи іншому варіанті є найкращим в світі підвищення специфічності аналізу. Однак до недоліків зондів відноситься висока вартість, що виконує роботу з підбору зондів, праймерів і умов ампліфікації дорогою. Разом з тим, використання інтеркаліруючих агентів є дуже простим і дешевим. Відпадає необхідність підбору спеціальних праймерів, зондів, оскільки можна користуватися вже використовуваними праймерами, ефективність роботи яких вже перевірена. Ці обставини роблять застосування інтеркаліруючих агентів вельми привабливим.

Висновок

В даний час створена наукова і матеріально-технічна база для широкого впровадження в клінічну лабораторну діагностику нової генодіагностичної технології – кількісного визначення ДНК/РНК інфекційних агентів – ПЛР в реальному часі (Real-Time PCR). У найближчі роки ця технологія буде застосовуватися в гепатології (вірусні гепатити В і С), в клініці ВІЛ і ВІЛ-асоційованих інфекцій (в першу чергу герпетична і цитомегаловірусна інфекції), в дерматовенерології, фтизіатрії, гастроентерології, пульмонології. За допомогою ПЛР в реальному часі буде оцінюватися ефективність проведеної терапії і клінічний прогноз захворювання.

наші
лікарі

Зуєв Костянтин Олександрович

Ендокринолог.

Досвід лікарської практики 15 років.

Лікар першої категорії, кандидат медичних наук.

Федоренко Олександр Євгенійович

Дерматовенеролог, дерматолог, венеролог.

Досвід лікарської практики 29 років.

Лікар вищої категорії, доктор медичних наук.

Нікольський Ігор Сергійович

Лікар клінічний імунолог вищої категорії. Доктор медичних наук.

Соломенний Руслан Іванович

Лікар уролог, фахівець УЗД

Досвід лікарської практики 5 років.

Заседа Юрій Ігорович

Андролог, сексолог, уролог, репродуктолог, психотерапевт.

Досвід лікарської практики понад 31 рік.

Лікар вищої категорії. Доктор медичних наук. Засновник і головний лікар клініки.

Півень Володимир Ігнатович

Консультант инфекционист, гастроэнтеролог, гепатолог. 

Доцент кафедры инфекционных заболеваний, кандидат медицинский наук.

* При записи на прием, в контактных данных пациента, обязательно оставьте свой e-mail, для того чтобы клиника могла связаться с вами и подтвердить запись! Смс-сервис временно не работает.

Режим роботи
Щодня з 8.00 до 20.00
Київ | вул. Лаврська, 4